Las pruebas de Rojo de Metilo (RM) y Voges-Proskauer (VP) son dos pruebas bioquímicas importantes utilizadas en microbiología. Estas pruebas, junto con las pruebas de Indol y Citrato, conforman el IMViC, un conjunto de pruebas fundamentales para la identificación de bacterias, especialmente las Enterobacterias.
Se emplean fundamentalmente para la identificación de las Enterobacterias (bacilos Gram negativos, anaerobios facultativos con metabolismo fermentador). Dependiendo de las condiciones, las enterobacterias, pueden realizar un metabolismo aerobio (si disponen de oxígeno), realizar una respiración anaerobia (si hay nitratos u otro aceptor de electrones) y distintas fermentaciones.
Árbol filogenético de Enterobacteriaceae
IMViC: Un Conjunto de Pruebas Clave
El IMViC es una prueba utilizada en microbiología para la identificación de bacterias. Se compone de cuatro pruebas: Indol, Rojo de metilo, Voges-Proskauer y Citrato. El resultado de este test se expresa mediante símbolos de positivo o negativo (+ o −) según el resultado de cada prueba, siguiendo siempre el orden establecido por las iniciales del método. Así por ejemplo, el IMViC de la bacteria Salmonella y Citrobacter es −+−+.
1. Prueba de Indol
Se determina si la bacteria posee una enzima (triptofanasa). La triptofanasa hidroliza el triptófano en indol y alanina. El indol se detecta empleando un reactivo específico (Reactivo de Kovacs). El triptófano forma parte de las peptonas del medio.
Método: Inocular el medio de cultivo (agua de peptona). Añadir unas gotas de reactivo de Kovacs. Agitar y dejar reposar el cultivo. El HCl proporciona el pH ácido que requiere la reacción. A la izquierda se observa un cultivo de E.
2. Prueba de Rojo de Metilo (RM)
El rojo de metilo es un indicador de pH. (Fórmula: C15H15N3O2). Actúa entre pH 4,2 y 6,3 variando desde rojo (pH 4,2) a amarillo (pH 6,3). Por lo tanto, permite determinar la formación de ácidos orgánicos que se producen durante la fermentación de un carbohidrato.
Fundamento: Detecta la fermentación ácido-mixta. Se acumulan ácidos (acético, fórmico, etc.), relativamente fuertes y bajan el pH del medio hasta 4-5.
El microorganismo en estudio se cultiva en un caldo de cultivo con algún carbohidrato fermentable (el más común es la glucosa aunque se pueden utilizar otros carbohidratos como lactosa, sacarosa, manitol, etc.) junto con el rojo de metilo como indicador de pH. Una reacción positiva, es decir, el viraje del medio a un color rojo, indica que el microorganismo realiza la fermentación de la glucosa por la vía ácido-mixta y el pH del medio se torna hasta 4,2 por la gran cantidad de ácidos orgánico producidos.
Método: Inocular el medio de Clark-Lubs. Incubar a 37 oC durante 48 horas.
Resultado: A la izquierda un cultivo de E.
3. Prueba de Voges-Proskauer (VP)
Presentación Medio Rojo de Metilo Voges Proskauer
Algunos microorganismos producen acetoína o acetil metil carbinol por descarboxilación de dos moléculas de ácido pirúvico (producto final de la glucólisis).
Fundamento: Detecta la fermentación butanodiólica. En esta fermentación se producen menor cantidad de ácidos que en la fermentación ácido-mixta, y una gran cantidad de butanodiol. Mediante un reactivo, (alfa-naftol y KOH al 40%), se detecta la presencia de un precursor del butanodiol (acetilmetilcarbinol o acetoína).
La acetoína en un medio fuertemente alcalino (NaOH o KOH) y en presencia de oxígeno se oxida a diacetilo. El diacetilo reacciona con compuestos que contengan núcleos de guanidina, como la arginina, presente en el medio (peptona, por ejemplo) y da un compuesto color rojo-rosado-violáceo.
Materiales y reactivos: El medio de cultivo, es el mismo que en la prueba del rojo de metilo.
Método: Inocular el medio de Clark-Lubs. Añadir unas gotas alfa-naftol (0.6 ml). Agitar y añadir KOH (0.2 ml). Agitar. La acetoína en contacto con el oxígeno y la potasa origina diacetilo. El alfa naftol incrementa la sensibilidad de la reacción. El diacetilo origina un compuesto de color rosado. La prueba será positiva si en 20 minutos aparece una coloración roja. Los cultivos negativos se incuban 1-2 horas a 37 oC en posición inclinada efectuándose de nuevo la lectura. (El contacto con el oxígeno y la elevada temperatura favorecen la reacción).
A la izquierda cultivo de Serratia spp. Y a la derecha de E.
4. Prueba de Citrato
Sirve para determinar si un microorganismo puede crecer utilizando citrato como única fuente de carbono debido a la síntesis de la enzima citrato permeasa la cual permite la introducción del citrato al interior de la célula, una vez dentro, el citrato es incorporado al ciclo de los ácidos tricarboxilicos o ciclo de Krebs.
Fundamento: Se determina la utilización del citrato como única fuente de carbono y energía. La prueba emplea un medio definido (Koser) con citrato como única fuente carbonada (se detecta turbidez). Alternativamente se utiliza el medio de Simmons: utiliza un medio sólido con citrato sódico y un indicador ácido-base (azul de bromotimol). En este caso se detecta la alcalinización del medio por el consumo del citrato.
Se hace crecer al microorganismo en estudio en caldo citrato. Un resultado positivo es cuando se observa turbidez en el tubo, debido al crecimiento bacteriano. Un resultado negativo es cuando no se observa crecimiento.
Actualmente el medio más utilizado es el Agar Citrato de Simmons un medio sólido en tubo con pico de flauta el cual posee un indicador de pH (azul de bromotimol). Si el microorganismo es capaz de crecer con citrato como única fuente de carbono, también será capaz de utilizar las sales de amonio como única fuente de nitrógeno; con la liberación del amoniaco en utilización de las sales de amonio el pH aumentara y el indicador dará un viraje a azul, dando un resultado positivo.
Método: Inocular uno de los medios: El medio de Simmons es sólido, y se siembra por estría con asa de platino.
Resultado: Detectar el crecimiento en el medio de Koser por turbidez. Crecimiento en el medio de Simmons: a la izquierda cultivo de Salmonella spp. y a la derecha de E. coli. *Dado que la lectura del medio de Koser se hace detectando la turbidez del medio, es necesario inocular con una pequeña cantidad de bacterias y comprobar que el tubo permanece casi transparente tras la inoculación.
Materiales Adicionales
| Material | Descripción |
|---|---|
| Asa de siembra de 1µl | Fabricada en PS. Estéril. Embolsada en peel-packs de 20 unidades con número de lote y fecha de caducidad. |
| Asa de siembra de 10µl | Fabricada en PS. Estéril. Embolsada en peel-packs de 20 unidades con número de lote y fecha de caducidad. |
| Frascos ISO transparente | Retrace code y doble escala graduada. SCHARLAU. Cap. (ml): 100, 250, 500, 1.000. |
Scharlab S.L.Gato Pérez, 33. Pol. Ind.